Gebruik en voorzorgsmaatregelen van de ultrafiltratiecentrifugebuis
1) Kies een geschikte ultrafiltratiebuis.Merk op dat UF-membranen verschillen in hun tolerantieniveau voor verschillende chemicaliën.Typisch kunnen ultrafiltratiebuizen met een molecuulgewichtgrens van 10 kDa worden geselecteerd met een molecuulgewichtgrens die niet groter mag zijn dan 1/3 van het molecuulgewicht van het betreffende eiwit, zoals 35 kDa.Als het molecuulgewicht van het betreffende eiwit ongeveer 10 kD bedraagt, kan een ultrafiltratiebuis met een molecuulgewichtgrens van 3 KD worden gebruikt.
(2) De ultrafiltratie, vers gekocht, is droog, waarbij vóór gebruik ultrapuur water wordt toegevoegd en het water volledig door het membraan, het ijsbad of de koelkast wordt geleid en een paar minuten wordt voorgekoeld.Vervolgens wordt het water afgegoten, dat wil zeggen de eiwitvloeistof, en hoeveel wordt toegevoegd, afhankelijk van wat niet meer is dan de witte lijn bovenaan de buis.De operatie is licht en de ultrafiltratiebuis moet worden voorgekoeld op ijs voordat de eiwitoplossing wordt toegevoegd.
3) Zowel de massa als het zwaartepunt moesten de balans bereiken.Merk op dat de rotatiesnelheid en versnelling niet erg snel zijn, anders wordt het ultrafiltratiemembraan direct beschadigd.Centrifugale ultrafiltratie werd gestart (centrifuge voorgekoeld tot 4 graden).Nadat het toerental van verschillende centrifuges was omgerekend naar g, was het anders.De versnelling van de centrifuge werd tot een minimum beperkt, waardoor de druk op het membraan werd verlaagd.Let op: zorg ervoor dat u de centrifuge verlaat nadat de centrifuge de bestemmingssnelheid heeft bereikt, of als u een probleem ondervindt, kunt u deze voor de eerste keer niet aan.De oriëntatie van het membraan ten opzichte van de spil werd aangepast volgens de instructies (de hoekige centrifugebehuizing staat loodrecht op de as van het membraan).In praktisch gebruik is de algemene rotatiesnelheid lager dan die in de instructies, waardoor de levensduur van de centrifugebuis kan worden verlengd.
3) Zowel de massa als het zwaartepunt moesten de balans bereiken.Merk op dat de rotatiesnelheid en versnelling niet erg snel zijn, anders wordt het ultrafiltratiemembraan direct beschadigd.Centrifugale ultrafiltratie werd gestart (centrifuge voorgekoeld tot 4 graden).Nadat het toerental van verschillende centrifuges was omgerekend naar g, was het anders.De versnelling van de centrifuge werd tot een minimum beperkt, waardoor de druk op het membraan werd verlaagd.Let op: zorg ervoor dat u de centrifuge verlaat nadat de centrifuge de bestemmingssnelheid heeft bereikt, of als u een probleem ondervindt, kunt u deze voor de eerste keer niet aan.De oriëntatie van het membraan ten opzichte van de spil werd aangepast volgens de instructies (de hoekige centrifugebehuizing staat loodrecht op de as van het membraan).In praktisch gebruik is de algemene rotatiesnelheid lager dan die in de instructies, waardoor de levensduur van de centrifugebuis kan worden verlengd.
(4) Neem, wanneer geconcentreerd tot de resterende 1 ml, 50 ul bufferoplossing, voeg 10 ul doorstroom toe en kijk of er een blauwe kleur is, om te beoordelen of er eiwit ontbreekt in de ultrafiltratiebuis.Als de buis lekt, giet u de bovenste laag opnieuw en laat u deze doorstromen in een nieuwe buis om de ultrafiltratie te starten.Om precies te bepalen of er buisjes zijn gemist, centrifugeert u gedurende 10 minuten met 5 mg ml BSA voordat u doorstroomt, waarbij u de eiwitlijm of de ruwe Bradford-test gebruikt, en gaat u verder met het toevoegen van de resterende geconcentreerde eiwitoplossing (die op ijs werkt en voorkomt dat eiwitten opwarmen) totdat al het concentraat is toegevoegd.Wees voorzichtig tijdens het centrifugeren als er neerslag van eiwitten optreedt, wat leidt tot sluiting van de buisjes.Als er neerslag optreedt, bepaal dan of de specifieke oorzaak van de neerslag een te hoge eiwitconcentratie of een ongepaste buffer is;De eerste kan worden opgelost door gelijktijdig ultrafiltratie van meerdere ultrafiltratiebuizen, waardoor de concentratie wordt verlaagd, en de laatste door verschillende bufferoplossingen uit te wisselen totdat er geen precipitatie van het eiwit optreedt.
(4) Neem, wanneer geconcentreerd tot de resterende 1 ml, 50 ul bufferoplossing, voeg 10 ul doorstroom toe en kijk of er een blauwe kleur is, om te beoordelen of er eiwit ontbreekt in de ultrafiltratiebuis.Als de buis lekt, giet u de bovenste laag opnieuw en laat u deze doorstromen in een nieuwe buis om de ultrafiltratie te starten.Om precies te bepalen of er buisjes zijn gemist, centrifugeert u gedurende 10 minuten met 5 mg ml BSA voordat u doorstroomt, waarbij u de eiwitlijm of de ruwe Bradford-test gebruikt, en gaat u verder met het toevoegen van de resterende geconcentreerde eiwitoplossing (die op ijs werkt en voorkomt dat eiwitten opwarmen) totdat al het concentraat is toegevoegd.Wees voorzichtig tijdens het centrifugeren als er neerslag van eiwitten optreedt, wat leidt tot sluiting van de buisjes.Als er neerslag optreedt, bepaal dan of de specifieke oorzaak van de neerslag een te hoge eiwitconcentratie of een ongepaste buffer is;De eerste kan worden opgelost door gelijktijdig ultrafiltratie van meerdere ultrafiltratiebuizen, waardoor de concentratie wordt verlaagd, en de laatste door verschillende bufferoplossingen uit te wisselen totdat er geen precipitatie van het eiwit optreedt.
(5) De eerste paar stappen worden gebruikt om het eiwit te concentreren, en als de buffer moet worden vervangen, voeg dan voorzichtig een nieuwe buffer toe (ultrafiltratie door een ultrafiltratiemembraan van 0,22 µm) tot ongeveer 1 ml totaal eiwit, en concentreer opnieuw tot ongeveer 1 ml gedurende drie opeenvolgende keren, waarbij het uiteindelijke geconcentreerde eindvolume afhankelijk is van de gewenste eiwitconcentratie, doorgaans niet meer dan 500 ul, maar ook binnen 200 ul.Bij drie gelegenheden 1000 × of meer bereiken, in wezen evenveel bufferverandering, berekend door elke keer minstens 10 × volumeverrijking.
(5) De eerste paar stappen worden gebruikt om het eiwit te concentreren, en als de buffer moet worden vervangen, voeg dan voorzichtig een nieuwe buffer toe (ultrafiltratie door een ultrafiltratiemembraan van 0,22 µm) tot ongeveer 1 ml totaal eiwit, en concentreer opnieuw tot ongeveer 1 ml gedurende drie opeenvolgende keren, waarbij het uiteindelijke geconcentreerde eindvolume afhankelijk is van de gewenste eiwitconcentratie, doorgaans niet meer dan 500 ul, maar ook binnen 200 ul.Bij drie gelegenheden 1000 × of meer bereiken, in wezen evenveel bufferverandering, berekend door elke keer minstens 10 × volumeverrijking.
Posttijd: 09-nov-2022