PCR, is de polymerasekettingreactie, die verwijst naar de toevoeging van dNTP, Mg2+, verlengingsfactoren en amplificatieverbeteringsfactoren aan het systeem onder de katalyse van DNA-polymerase, waarbij het ouder-DNA als matrijs wordt gebruikt en specifieke primers als het startpunt van de verlenging. Via de stappen van denaturatie, annealing, verlenging, enz. kan het proces van het in vitro repliceren van dochterstreng-DNA dat complementair is aan het template-DNA van de ouderstreng snel en specifiek elk doel-DNA in vitro amplificeren.
1. Hotstart-PCR
De starttijd van amplificatie bij conventionele PCR is niet het plaatsen van de PCR-machine in de PCR-machine, waarna het programma begint te amplificeren.Wanneer de systeemconfiguratie is voltooid, begint de amplificatie, wat niet-specifieke amplificatie kan veroorzaken, en hot-start PCR kan dit probleem oplossen.
Wat is hotstart-PCR?Nadat het reactiesysteem is voorbereid, wordt de enzymmodificator bij hoge temperatuur (meestal hoger dan 90°C) vrijgegeven tijdens de initiële verwarmingsfase van de reactie of de “hot start”-fase, zodat het DNA-polymerase wordt geactiveerd.De exacte activeringstijd en temperatuur zijn afhankelijk van de aard van het DNA-polymerase en de hot-start-modificator.Deze methode maakt voornamelijk gebruik van modificatoren zoals antilichamen, affiniteitsliganden of chemische modificatoren om de activiteit van DNA-polymerase te remmen.Omdat de activiteit van DNA-polymerase bij kamertemperatuur wordt geremd, biedt hot-start-technologie veel gemak bij het bereiden van meerdere PCR-reactiesystemen bij kamertemperatuur zonder de specificiteit van PCR-reacties op te offeren.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse Tranction PCR) is een experimentele techniek voor reverse transcriptie van mRNA naar cDNA en het gebruik ervan als sjabloon voor amplificatie.De experimentele procedure is om eerst totaal RNA uit weefsels of cellen te extraheren, Oligo (dT) als primer te gebruiken, reverse transcriptase te gebruiken om cDNA te synthetiseren en vervolgens cDNA te gebruiken als sjabloon voor PCR-amplificatie om het doelgen te verkrijgen of genexpressie te detecteren.
3. Fluorescerende kwantitatieve PCR
Fluorescerende kwantitatieve PCR (realtime kwantitatieve PCR,RT-qPCR) verwijst naar de methode voor het toevoegen van fluorescerende groepen aan het PCR-reactiesysteem, waarbij de accumulatie van fluorescerende signalen wordt gebruikt om het gehele PCR-proces in realtime te volgen, en uiteindelijk de standaardcurve wordt gebruikt om de sjabloon kwantitatief te analyseren.Veelgebruikte qPCR-methoden zijn onder meer SYBR Green I en TaqMan.
4. Geneste PCR
Geneste PCR verwijst naar het gebruik van twee sets PCR-primers voor twee ronden PCR-amplificatie, en het amplificatieproduct van de tweede ronde is het doelgenfragment.
Als een mismatch van het eerste paar primers (buitenste primers) ervoor zorgt dat een niet-specifiek product wordt geamplificeerd, is de mogelijkheid dat hetzelfde niet-specifieke gebied door het tweede paar primers wordt herkend en doorgaat met amplificeren zeer klein, zodat de amplificatie door het tweede paar primers is de specificiteit van PCR verbeterd.Eén voordeel van het uitvoeren van twee rondes PCR is dat het helpt om voldoende product uit een beperkt uitgangs-DNA te amplificeren.
5. Touchdown-PCR
Touchdown PCR is een methode om de specificiteit van de PCR-reactie te verbeteren door de PCR-cyclusparameters aan te passen.
Bij touchdown-PCR wordt de annealingstemperatuur voor de eerste paar cycli een paar graden boven de maximale annealingstemperatuur (Tm) van de primers ingesteld.Een hogere annealingstemperatuur kan niet-specifieke amplificatie effectief verminderen, maar tegelijkertijd zal een hogere annealingstemperatuur de scheiding van primers en doelsequenties verergeren, wat resulteert in een verminderde PCR-opbrengst.Daarom wordt de annealingstemperatuur gewoonlijk ingesteld om tijdens de eerste paar cycli met 1°C per cyclus te dalen om de inhoud van het doelgen in het systeem te verhogen.Wanneer de gloeitemperatuur wordt verlaagd tot de optimale temperatuur, wordt de gloeitemperatuur gedurende de resterende cycli gehandhaafd.
6. Directe PCR
Directe PCR verwijst naar de amplificatie van doel-DNA rechtstreeks uit het monster zonder de noodzaak van nucleïnezuurisolatie en -zuivering.
Er zijn twee soorten directe PCR:
directe methode: neem een kleine hoeveelheid monster en voeg dit direct toe aan PCR Master Mix voor PCR-identificatie;
kraakmethode: voeg het monster na bemonstering toe aan het lysaat, lyseer om het genoom vrij te geven, neem een kleine hoeveelheid gelyseerd supernatant en voeg het toe aan PCR Master Mix, voer PCR-identificatie uit.Deze aanpak vereenvoudigt de experimentele workflow, vermindert de hands-on tijd en vermijdt DNA-verlies tijdens zuiveringsstappen.
7. SOE-PCR
Gensplitsing door overlap-extensie-PCR (SOE PCR) maakt gebruik van primers met complementaire uiteinden om PCR-producten overlappende ketens te laten vormen, zodat in de daaropvolgende amplificatiereactie, door de verlenging van de overlappende ketens, verschillende bronnen van een techniek waarbij geamplificeerde fragmenten elkaar overlappen en aan elkaar gesplitst.Deze technologie kent momenteel twee belangrijke toepassingsrichtingen: constructie van fusiegenen;gen-plaatsgerichte mutatie.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) maakt gebruik van omgekeerde complementaire primers om andere DNA-fragmenten dan de twee primers te amplificeren, en amplificeert onbekende sequenties aan beide zijden van een bekend DNA-fragment.
IPCR is oorspronkelijk ontworpen om de sequentie van aangrenzende onbekende gebieden te bepalen, en wordt meestal gebruikt om genpromotorsequenties te bestuderen;oncogene chromosomale herschikkingen, zoals genfusie, translocatie en transpositie;en virale genintegratie worden tegenwoordig ook vaak gebruikt. Voor plaatsgerichte mutagenese kopieert u een plasmide met de gewenste mutatie.
9. dPCR
Digitale PCR (dPCR) is een techniek voor de absolute kwantificering van nucleïnezuurmoleculen.
Er zijn momenteel drie methoden voor de kwantificering van nucleïnezuurmoleculen.Fotometrie is gebaseerd op de absorptie van nucleïnezuurmoleculen;real-time fluorescente kwantitatieve PCR (Real Time PCR) is gebaseerd op de Ct-waarde, en de Ct-waarde verwijst naar het cyclusnummer dat overeenkomt met de fluorescentiewaarde die kan worden gedetecteerd;digitale PCR is de nieuwste kwantitatieve technologie gebaseerd op de PCR-methode met één molecuul voor het tellen van nucleïnezuren. Kwantificering is een absolute kwantitatieve methode.
Posttijd: 13 juni 2023